Engineered adhesion peptides for functionalization of natural surfaces, polymers, and metal alloys

  • Maßgeschneiderte Adhäsionspeptide für die Funktionalisierung von natürlichen Oberflächen, Polymeren und Metalllegierungen

Apitius, Lina; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Pich, Andrij (Thesis advisor)

Aachen (2019)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Plastik oder synthetische organische Polymere werden seit den frühen 1950er Jahren im Großmaßstab hergestellt. Bis heute wurden für unzähligen Anwendungen insgesamt in etwa 8300 Millionen metrische Tonnen an Plastik hergestellt. Die generellen Eigenschaften des Plastiks sind dabei oft nicht optimal für die vorhergesehene Anwendung (z.B. Benetzbarkeit, Biokompatibilität oder antistatische und schmutzabweisende Eigenschaften) und werden oft durch physikalische oder chemische Techniken angepasst. Behandlungen des Plastiks mit UV-, Flammen- oder Plasma-Bestrahlung sowie chemischen Detergenzien generieren häufig große Mengen an giftigen Abfallstoffen oder haben ein erhöhtes Gefährungspotenzial für die Anwender. Der Einsatz von Ankerpeptiden ermöglicht eine biologische Oberflächenfunktionalisierung von Polymeren mit einer extrem hohen Beschichtungsdichte (bis zur Monolage). Zusätzlich können durch Ankerpeptide multiple Eigenschaften (z.B. NH2-, COOH- oder OH-Gruppen) gleichzeitig auf eine Oberfläche gebracht werden. Ankerpeptide sind sehr divers in ihrer Länge, Sekundärstruktur, Bindeaffinität als auch Bindestärke. Eine generelle Ankerpeptid-Plattform wurde entwickelt, die mit Hilfe des fusionierten grün-fluoreszierenden Reporterproteins eGFP erlaubte, geeignete Oberflächenbindepeptide zu identifizieren. Um unter Anwendungsbedingungen gute Bindeeigenschaften zu zeigen, müssen potentielle Ankerpeptide durch gelenkte Evolution angepasst werden. Konventionelle Methoden der Vielfaltsgenerierung haben für Ankerpeptide (12-100 Aminosäuren) eine zu niedrige Mutageneserate und müssen an deren kurzen Sequenzen angepasst werden. Ein Peptid-Polymer Evolutionsprotokoll (PePevo Protokoll) wurde etabliert, dass eine sehr hohe epPCR-basierte Mutagenesefrequenz des Ankerpeptids Tachystatin A2 ermöglichte (59 Mutationen/kb). Das Ankerpeptid Tachystatin A2 wurde für eine verstärkte Anbindung an Polystyrol evolviert. Der Fusionspartner eGFP wurde in einem Fluoreszenzassay genutzt, um die Bindung des Peptids an die Oberfläche von Mikrotiterplatten zu quantifizieren. Um die Zuverlässigkeit des Assays zu verbessern wurden die eingesetzte Proteinkonzentration, die Standardabweichung sowie der Selektionsdruck optimiert. Verbesserte Polystyrol-Bindevarianten des Tachystatin A2 konnten mit Hilfe des anionische Tensids Natriumdodecylbenzolsulfonat (LAS) identifiziert werden, dass als Selektionsdruck eingesetzt wurde. Mit Hilfe des PePevo Protokolls wurde in einer Runde gelenkter Evolution bis zu sechsfach verbesserte Polystyrol-Bindevarianten des Tachystatin A2 in Anwesenheit von 0,5 mM LAS identifiziert. Eine Limitierung der gelenkten Evolution ist der Screening Durchsatz, der notwendig ist, um einen aussagekräftigen Anteil der generierten Variantenvielfalt zu analysieren. Eine Hochdurchsatz Escherichia coli Plattform (>10$^{6}$ Varianten) wurde etabliert, die es erlaubte, Ankerpeptide auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Das Polypropylen-Bindepeptid LCI (liquid chromatography peak I) wurde mit Hilfe einer Esterase A auf der Zelloberfläche präsentiert und konnte die E. coli Zellen auf Polypropylen immobilisieren. Auf diese Weise konnten Zellen, die stark bindende LCI-Varianten auf der Oberfläche präsentieren aus dem Kulturüberstand angereichert werden. In einem semi-rationalen Ansatz wurden fünf Positionen des LCIs simultan mutagenisiert und eine bis zu zwölffach verbesserte Polypropylen-Bindevariante konnte in Anwesenheit von 0,125 mM LAS identifiziert werden. Die Anwendung von Polymeren in der medizinischen Praxis (z.B. als Katheter oder Stents) ist oftmals durch eine geringe Biokompatibilität begrenzt. Medizinische Implantate führen häufig zu schweren Infektionen in Patienten. Implantate sind daher oft mit Medikamenten- oder Antibiotika-eluierenden Beschichtungen ausgerüstet. Die Vielseitige Anwendbarkeit der Ankerpeptide führte zu der Generierung von biadhäsiven Peptiden, die in der Lage sind, an zwei unterschiedlichen chemischen Komponenten zu binden und als Kleber zu fungieren. Ein biadhäsives Peptid wurde erzeugt, das aus einem Edelstahl-Bindepeptid (Dermaseptin S1), einem Separator und einem Polycaprolacton (PCL)-Bindepeptid (LCI) aufgebaut war. Durch den Einsatz von DermaseptinS1-Domain Z-LCI konnten Antibiotika-beladene PCL Mikrocontainer auf einer Edelstahloberfläche immobilisiert werden. Die antimikrobielle Aktivität des beschichteten Edelstahls wurde durch die wachstumshemmende Wirkung auf E. coli Zellen bestätigt. Der Einsatz von biadhäsiven Peptiden ermöglicht die Entwicklung von Medikamenten-eluierenden Edelstahlstents. Die Umweltverschmutzung durch Mirkoplastik wird auch immer mehr für die Menschheit zur Bedrohung. Um akkumulierendes Plastik zu minimieren, kann eine enzymatische Depolimerisierung von Polymeren wie Polyurethan eingesetzt werden. Das Mikroplastik kann somit vorteilhafter Weise in CO2, Monomere und wertvolle Komponenten umgewandelt werden. Die Polyester-Polyurethan abbauende Cutinase Tcur1278 wurde mit dem Ankerpeptid Tachystatin A2 fusioniert. Der Anker vermittelte eine gerichtete Anbindung des Enzyms an die Nanopartikel und konnte sowohl die Abbaurate des Enzyms als auch die Halbwertszeit der Nanopartikel in stark verdünnten Lösungen bei Raumtemperatur um das sechsfache verbessern bzw. verringern. Damit bietet sich eine Anwendung der Technologie zum Plastikabbau in der Wasseraufbereitung an.

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